IV. PROPIEDADES DEL POTENCIAL DE ACCION
Mientras en la mitad del siglo XIX Alemania ya tenía una escuela de fisiología extraordinariamente productiva fundada por Joannes Müller, en Inglaterra no se hacían trabajos fisiológicos. Sin embargo, a finales del siglo XIX esa situación cambió y la electrofisiología empezó a ser practicada vigorosamente.
En 1836 se creó la Cátedra de Fisiología y Anatomía en el University College de Londres y su primer ocupante, William Sharpey (1802-1880) era un anatomista. Sin embargo, aunque la fisiología se enseñaba por medio de libros y no se hacía investigación, uno de los estudiantes de Sharpey, Michael Foster (1836-1907), fundó la Escuela de Fisiología de Cambridge, una de las mas productivas de Europa. Dos de sus estudiantes alcanzaron un gran reconocimiento por su trabajo en neurofisiología, Sir Charles Scott Sherrington (1857-1952) y John Newport Langley (1852-1925). Entre los estudiantes de este último se encontraron, Keith Lucas (1879-1916), quien murió prematuramente el 5 de octubre de 1916 en un accidente de aviación y Edgar Douglas Adrian (1889-1977), posteriormente Lord Adrian.
El experimento básico con el que se mostraba la existencia de una perturbación propagada en el nervio producía resultados tan misteriosos para los investigadores de principio del siglo XX como lo habían sido para Galvani y Matteucci. Cuando se comprime el extremo de un nervio motor que aún está unido al músculo (como en la preparación ciático-gastrocnemio) éste se contrae, aparentemente en forma simultánea con el estímulo y el fisiólogo inglés Sir William Maddock Bayliss escribió en 1915:
"No se vé que pase nada en el nervio y, sin embargo, algo debe pasar a lo largo del nervio desde el punto donde es pinchado, ya que de otra manera el músculo no se enteraría de que algo ha ocurrido al otro extremo del nervio. Es común hablar de un 'disturbio propagado' que pasa a lo largo del nervio o, algunas veces, de un impulso nervioso. Pero ¿cómo vamos a detectar e investigarlo en el nervio mismo, separado de músculo indicador?"
Los intentos para detectar cambios químicos o metabólicos durante el paso del potencial de acción fallaron. En 1912 A.V. Hill trató de medir la producción de calor en el nervio, pero concluyó que una sola perturbación propagada no producía mas de 10(-8) grados centigrados. Debido a esto, los investigadores se limitaron a estudiar los signos eléctricos de la actividad del nervio, algo que se podía hacer con cierta precisión con la instrumentación de aquella época. Las siguientes son algunas de las propiedades del potencial de acción que se podían seguir.
La mayor parte del trabajo en electrofisiología que se hizo en la década de los 1930 estaba principalmente dirigido a tres objetivos: a) caracterizar mejor las propiedades del impulso nervioso por medio de una mejor instrumentación; b) entender el significado fisiológico del potencial de acción, esto es, el papel de las fibras nerviosas como acarreadoras de información, y; c) elucidar la esencia del impulso nervioso, esto es, la física y la química de la excitación.
1. Curso temporal
Era bastante claro que un nervio excitado se hacía eléctricamente negativo con respecto a un punto en reposo y que los cambios eléctricos que producía el estímulo viajaban a lo largo del nervio, haciendo que cada segmento de éste se volviera electronegativo con respecto al resto. Esto explicaba el curso temporal del potencial de acción extracelular registrado con dos electrodos (A y B), ya que primero A se volvía negativo y B positivo, y después A era positivo y B negativo, dando origen a la típica deflexión difásica. Pero si el electrodo B se colocaba en un punto del nervio que hubiera sido lastimado, por ejemplo calentándolo, el único efecto eléctrico que se veía era la negatividad en A. La consecuencia de esto era que el potencial de acción extracelular se hacía monofásico.
2. Características todo-o-nada
Los experimentos de Keith Lucas en 1909 habían demostrado que al variar la intensidad del estímulo excitatorio aplicado al nervio ciático se obtenían diferentes grados de contracción en el músculo y que estos no eran tan numerosos como los grados de intensidad del estímulo; además, las contracciones ocurrían en escalones menos numerosos que el número de fibras motoras. Estos resultados fueron considerados como una indicación de que los diferentes grados de contracción eran debidos solamente al número de fibras musculares contrayéndose; en otras palabras, cada fibra nerviosa o muscular podía ser excitada a su máxima capacidad o no serlo.
Ese hecho ya había sido observado en 1871 por H.P. Bowditch (1840-1911) estimulando directamente el corazón y la posibilidad de que el fenómeno también pudiera ser aplicado al nervio había sido discutida en 1902 por Francis Gotch (1853-1913). Sin embargo, la demostración del caracter todo-o-nada de la excitación propagada fue obtenida por Adrian (1914), quien pudo demostrar que después de pasar una regíon anestesiada del nervio ciático, el potencial de acción recuperaba su máxima amplitud cuando entraba a un área normal.
3. ¿Existen perturbaciones nerviosas de diferentes tipos?
Esta pregunta atrajo mucho la atención de los investigadores, sin embargo, nunca se pudo demostrar que estímulos diferentes o con diferentes duraciones o intensidades, dieran origen a más de un tipo de respuesta en el nervio. Aún cuando ya se había observado que estímulos de larga duración y cuya amplitud aumentaba lentamente originaban contracciones anormalmente largas, se demostró que esto era debido al hecho de que el estímulo producía trenes de potenciales de acción que, en consecuencia, estimulaban repetitivamente (tetanizan) el músculo.
4. Especificidad de las respuestas producidas por el nervio
Los investigadores del final del siglo XIX también se habían preguntado si los efectos obtenidos por la estimulación de diferentes nervios, como por ejemplo la excitación o la inhibición de un músculo, eran debidos a diferencias en los potenciales de acción y un experimento hecho en 1898 por Langley ayudó a resolver este problema. Langley cortó el nervio vago y unió el extremo central con el extremo periférico del simpático cervical, que también había cortado y después de un tiempo adecuado durante el cual el nervio regeneró, pudo demostrar que la estimulación del vago producía los mismos efectos que anteriormente había producido la estimulación del simpático. Este elegante experimento fue la clave para sugerir que los diferentes efectos del vago y el simpático no se debían a las características de sus potentiales de acción, sino a las propiedades de sus terminales.
5. Período refractario
En 1899 Francis Gotch (1853-1913) y Burchen demostraron que cuando dos estímulos separados por un intervalo menor de aproximadamente 8 mseg (dependiendo de la temperatura) eran aplicados al nervio, el segundo estímulo no producía una perturbación propagada. Esto significaba que inmediatamente después del estado excitado el nervio se encontraba inexcitable y Adrian y Lucas (1912) estudiaron con cuidado éste fenómeno usando el músculo como indicador. Ellos demostraron que durante los primeros 25 mseg después de un estímulo el nervio no puede ser excitado por otro estímulo de cualquier intensidad (período refractario absoluto), pero que desde ese momento hasta aproximadamente 12 mseg la excitabilidad del nervio era menor que la normal, pero aumentaba gradualmente (período refractario relativo) y después, hasta aproximadamente 28 mseg, había un periodo de excitabilidad aumentada (período supernormal). Posteriormente el nervio regresaba a su estado de excitabilidad antes del primer estímulo.
6. Fatiga
El problema de la fatiga intrigaba tanto a los investigadores de aquel tiempo, que Baylis (1915) escribió: "Si vemos la fatiga como ese resultado de la actividad por el que es más difícil excitar una célula hasta que ha pasado cierto tiempo para que se recupere, es claro que el estado refractario mismo es uno de fatiga. Sin embargo, en condiciones ordinarias la recuperación es tan rápida, que es imposible demostrar que un nervio es menos excitable al final de un largo período de actividad que al principio." La preocupación por este problema estaba relacionada con la imposibilidad de los investigadores para demostrar la existencia del metabolismo de las fibras nerviosas, que puede verse por medio del consumo de oxígeno y la producción de calor.
Baylis añade: ". . . ya que debemos suponer que la fibra nerviosa está viva, es difícil creer que carece absolutamente de actividad respiratoria . . . el hecho de que ésta perturbación en el nervio normal sea propagada sin disminuir, sugiere un proceso físico . . . la energía le es proprocionada conforme viaja . . . es concebible que el material proporcionando la energía requiera reemplazo por un proceso de oxidación, pero de nuevo encontramos el problema de la ausencia de producción de calor. A.V. Hill sugiere que el oxígeno actúa para mantener funcional la maquinaria, como si fuera algo semejante a lo que le hace el aceite al motor. Debe confesarse que ésta parece una función rara para que la haga el oxígeno."
7. Suma y facilitación
Adrian y Lucas (1912) mostraron que hay una forma de aumeto de la excitabilidad que ocurre solamente en el punto donde se aplica un estímulo, lo que puede demostrarse aplicando dos estímulos inadecuados (debemos entender subumbrales) y si el segundo sigue al primero por aproximadamente 0.8 mseg, se produce una perturbación propagada. De esto es claro que el primer estímulo no fue efectivo para producir la perturbación propagada, pero dejó atrás una alteración de cierto tipo que persistió por un tiempo medible y que se añadió a la producida por el segundo estímulo. Estas observaciones fueron premonitorias de las respuestas graduadas, subumbrales, no propagadas, que Katz demostraría en los 1930's siguiendo una técnica semejante y que Hodgkin registraría directamente poco tiempo después.
8. Umbral
9. Impedancia
Kenneth S. Cole (1900-1984) era un físico que se interesó en las membranas biológicas muy al inicio de su carrera. En los 1920's trabajó con Hugo Fricke, quien había medido la impedancia que una suspensión de eritrocitos ofrece a la corriente alterna y calculado la resistencia y capacitancia de sus membranas, obteniendo un valor de 1 µf/cm2 para esta última. Posteriormente, Cole usó métodos semejantes y estudió las propiedades de las membranas de una gran variedad de células y después de la descripción hecha por J.Z. Young fue uno de los primeros en trabajar con el axón gigante del calamar.
Figura 1. Cambio en impedancia del axón gigante del calamar durante el potencial de acción (superimpuesto).
Una observación muy importante hecha por Cole y Curtis (1938) fue el hecho de que la impedancia de la membrana aumenta enormemente durante el paso del potencial de acción. Para estos registros ellos colocaron un axón entre dos electrodos que formaban parte de un circuito puente y balancearon el circuito hasta que la señal de a.c. fuera mínima. Entonces estimularon uno de los nervios y registraron tanto las corrientes de acción como el cambio en impedancia de la membrana durante el paso del potencial de acción, encontrando que la resistencia disminuía desde aproximadamente 1000 Ocm2 hasta solamente 25 Ocm2, mientras que no observaban cambios en la capacitancia. Con esto quedaba probada una vez más la hipótesis de Bernstein de que el potencial de acción se debía a un cambio en la selectividad iónica de la membrana.
10. Corrientes locales y Propagación
Uno de los primeros en proporcionar evidencias convincentes de que las corrientes eléctricas son los agentes causales de la actividad nerviosa fue Alan L. Hodgkin (1914- ), quien empezó a hacer experimentos en el verano de 1934 bajo la dirección de F.J.W. Roughton, cuando todavía era estudiante de Preparatoria y no le era claro si seguiría una carrera en Fisiología o Zoología. La lectura de libros como los de J. Gray (Experimental Cytology, 1931), A.V. Hill (Chemical Wave Transmission in Nerve, 1932), así como la revisión de Osterhout (1931), habían dirigido su interés hacia las membranas biológicas, de manera que los estudios de Blink (1930) le causaron gran impresión. Este había demostrado un aumento en la conductivdad de la membrana durante el potencial de acción en el alga Nitella y Hodgkin decidió que la misma evidencia faltaba en nervio. Así, trató de obtenerla usando un aparato diseñado por K. Lucas veinte años antes y que aún tenían en las aulas.
Para los experimentos Hodgkin bloqueó por enfriamiento una región del nervio ciático de rana y lo estimuló en dos puntos, antes y a nivel del bloqueo, con intervalos cuidadosamente medidos, mientras usaba como indicador de la efectividad del estímulo la contracción del músculo gastrocnemio, que registró en un quimógrafo. Creía que la permeabilidad y conductividad de la membrana aumentarían durante la actividad y que la llegada de un impulso a la zona bloqueada del nervio aumentaría la fracción de corriente que lo penetraba, disminuyendo el umbral eléctrico en la porción distal del bloqueo. Sin embargo, los resultados no apoyaron esas hipótesis (esto es, no se podían explicar por un aumento de la conductividad de la membrana) y, en cambio, podían ser explicados suponiendo que había circuitos locales que llevaban la corriente más allá del bloqueo, elevando la excitabilidad de esas zonas.
Esos resultados lo decepcionaron inicialmente, así que los abandonó y continuó sus estudios, durante los cuales leyó los trabajos del grupo de fisiólogos de St Louis, EUA (Erlanger, Gasser, Bishop, Graham, Lorente de Nó y Schmidtt), quienes entonces no creían en la hipótesis de la membrana en general, ni en los circuitos locales en particular. Para esa época Hodgkin ya había adquirido un osciloscopio y otro equipo eléctrico, y en el otoño de 1935 registró el potencial electrotónico producido por los circuitos eléctricos locales que difundían más allá de la región bloqueada. Esto demostró que la conducción es posible debido a que las fibras excitables tienen propiedades similares a las del cable. Así, cuando una fibra es excitada en un punto la corriente penetra a través de la región activa de la membrana y ya que se mueve en un circuito cerrado, las cargas eléctricas no pueden penetrar sin que una carga igual salga de la fibra. La fibra se comporta como un cable y por tanto la corriente no sale en el mismo punto en el que entró, sino un poco más adelante. Esta corriente de salida atraviesa la membrana en reposo retirando carga del capacitor de la membrana y despolarizando ese punto a un nivel más allá del umbral, iniciando la excitación de esa nueva región. Este proceso se repite y la región activa se mueve a la zona que previamente se encontraba en reposo.
A mediados de 1936 Hodgkin había terminado los experimentos principales y escribió los resultados en una Tésis para el Trinity College. Después recibió una beca con la que completó el trabajo y lo publicó casi exactamente tres años después de haber empezado los experimentos (Hodgkin, 1937a,b).
Para su siguiente trabajo Hodgkin ya estaba interesado en la teoría del cable y siguiendo un consejo de E.D. Adrian empezó a trabajar con el nervio de la pata del cangrejo, esperando probar que la acomodación podía deberse a la polarización de alguna estructura en serie con la fibra nerviosa. En este nervio encontró fácil aislar un solo axón, notando que un estímulo ligeramente subumbral producía un cambio parecido a un potencial de acción graduado, pero que crecía rápidamente cuando el estímulo se aproximaba al umbral (Hodgkin, 1937c). Lo sorprendente de este resultado, con el que se pudieron explicar resultados previos e inesperados obtenidos por Katz (1937), era el hecho de que esas respuestas graduadas se encontraran en un axón aislado, ya que hasta entonces todos los datos apuntalaban la característica todo-o-nada del potencial de acción.
En 1937 Hodgkin viajó a New York y después a St Louis, donde J. Erlanger le sugirió un experimento importante para apoyar la hipótesis de los circuitos locales, en el que la ateración del medio extracelular debería modificar la velocidad de propagación del potencial de acción. Este experimento fue llevado a cabo en New York sumergiendo un axón de la pata del cangrejo en aceite y obteniendo un gran cambio en la velocidad de conducción. Hodgkin hizo también otro experimento, cortocircuitando una fibra con pequeñas tiras de platino y obteniendo un claro aumento en la velocidad de conducción del potencial de acción. Estos experimentos proporcionaron aún más evidencias para apoyar la hipótesis de los circuitos locales y fueron publicados en 1939.
Después Hodgkin viajó a Woods Hole, Massachusetts, donde presenció una demostración del cambio en impedancia de la membrana del axón gigante del calamar durante el paso del potencial de acción. Fue también en esta ocasión cuando junto con H. Curtis hizo los primeros intentos para introducir un electrodo en el interior del axón con el fin de registrar el potencial de acción, experimentos que iban a tener éxito posteriormente.
De regreso en Inglaterra en el otoño de 1938 Hodgkin conoció a Andrew F. Huxley (1917- ), quien estaba tomando el curso de Fisiología y se le unió para unos experimentos. En estos midieron los potenciales extracelulares originados durante el paso del potencial de acción en axones de cangrejo sumergidos en aceite, usando como potencial de reposo la diferencia de potencial entre una región despolarizada por lesión y otra intacta, que era de aproximadamente 7 mV. Este valor contrastaba enormemente con los 73 mV del potencial de acción y a pesar que el mismo resultado había sido obtenido en axones de langosta, el estudio de las implicaciones tuvo que ser pospuesto hasta 1945, cuando ya casi había terminado la Segunda Guerra Mundial.
11. Potencial de acción compuesto
Usando por primera vez el osciloscopio de rayos catódicos como un aparato indicador, Gasser y Erlanger (1922) pudieron registrar varios picos en el potencial de acción registrado del nervio ciático de rana. Ellos correlacionaron esos componentes con las fibras de diámetros diferentes que forman el nervio y correctamente supusieron que los potenciales de acción generados por las fibras individuales se suman para dar el potencial de acción compuesto, cuya forma es regular si la distancia entre los electrodos de estimulación y de registro es corta. En cambio, si la distancia es grande, el potencial de acción se separa en los diferentes componentes que corresponden a las fibras con diferentes velocidades de conducción. Podríamos comparar este potencial de acción con los corredores en una carrera, que forman un grupo compacto inmediatamente después del inicio y, debido a sus diferentes velocidades, se separan en grupos conforme aumenta la distancia.
