2. La Membrana Celular

1. La necesidad de la membrana y sus características eléctricas

     El concepto inicial de la membrana como una estructura que separa la célula de su medio es atribuido a T. Schwann, quien indicó que el comportamiento de los tejidos animales, o vegetales, es gobernado por las actividades coordinadas de las células individuales de las que está compuesto. Así, siendo la célula la unidad del tejido, debería estar limitada por alguna estructura que preservara su identidad y evitara su fusión con las células adyacentes.
     El desarrollo del concepto de membrana se basó principalmente en estudios hechos en células vegetales, porque estas se prestan más que las células animales a los estudios microscópicos, especialmente en condiciones experimentales. Las células vegetales difieren de las animales principalmente en la presencia de una pared de celulosa, que en el tejido las separa de sus vecinas o del medio ambiente en los organismos formados por una sola célula, como las algas.
     Sin embargo, una véz aceptado que las células requieren aislarse del exterior por una membrana, el siguiente problema era la consttución del medio intracelular, en particular en relación a los iones, que tenían la posibilidad de formar parte de la corriente eléctrica que constituía la 'variación negativa' medida por Helmholtz y Du Bois-Reymond. Así, para finales del siglo XIX dos hipótesis sobre el significado de los iones intracelulares compartían la atención. En una se decía que el contenido de la célula podía ser visto como un coloide, de manera que la alta concentración iónica en el interior celular se debería a 'uniones' en una forma no osmótica., lo que llevó a considerar que los efectos del medio iónico de la célula eran una consecuencia de los efectos específicos de los coloides. La segunda hipótesis, en obvio conflicto con la primera, interpretaba los mismos eventos en términos de intercambios iónicos entre dos medios acuosos, el interior y el exterior, a través de una membrana selectivamente permeable.
     Las primeras respuestas sobre el tipo de medio en el que se encontraban los iones intracelulares fueron obtenidas por Höber (1910, 1912, 1913), quien trabajó en el laboratorio de Walther Nernst y con tres experimentos mostró que la conductancia del interior de los eritrocitos era parecida a la de los electrolitos biológicos y que la membrana era un mal conductor. Höber encontró que a una frecuencia de 1 KHz la resistividad de una masa de eritrocitos era 1200 Ocm, pero cuando la frecuencia era aumentada a 10 MHz la resistividad disminuía a 200 Ocm. Más aún, después que las células eran hemolizadas (rotas) con saponina la resistividad medida con frecuencias bajas tenía los mismos valores que aquella medida con frecuencias altas, que no cambiaba. Su conclusión fue que cuando las mediciones se hacían con frecuencias altas no había diferencias entre las células integras y las células destruidas, ya que lo que se medía en el primer caso era la resistividad de la solución interna y en el segundo la de la solución externa, siendo ambas electrolitos concentrados. Con estos experimentos se introdujo el concepto de la capacitancia de la membrana y la variación de su reactancia con la frecuencia de las señales eléctricas. Además, se mostró que las células pueden ser consideradas eléctricamente como formadas por un medio conductor (el citoplasma), separado del exterior por un dieléctrico no-conductor (la membrana).
     Resultados similares a los de Höber fueron obtenidos posteriormente por Osterhout (1922), quien midió la conductancia de la membrana del alga marina Laminaria  a 1 KHz y atribuyó su baja conductancia cuando estaba viva a la baja permeabilidad iónica de la membrana, ya que después de muerta tenían la misma conductancia que el agua de mar. Aproximadamente al mismo tiempo Philippson (1921) midió paquetes de eritrocitos, músculo esquelético e hígado, e interpretó sus resultados con el ahora conocido circuito de resistencia y capacitancia en paralelo (la membrana), a la que añadió una resistencia en serie (el citoplasma). Así, para 1922 ya era bastante claro que las células vivas tenían en el interior un electrolito buen conductor de la electricidad y que estaban rodeadas por una membrana relativamente impermeable y mala conductora de la electricidad.
     Trabajos posteriores hechos por Rogers y Cole (1925) en huevecillos del erizo de mar Arbacia punctulata , que son grandes y casi perfectamente esféricos, produjeron los mismos resultados que aquellos obtenidos por Höber con eritrocitos, confirmando las conclusiones sobre la capacitancia de la membrana. Además, fueron el inicio de numerosas mediciones hechas por Cole (rev, 1968) durante los siguientes 20 años, con las que fundamentó completamente el circuito equivalente usado para la interpretación de las mediciones eléctricas en las membranas de muchas células. Esta experiencia fue invaluable en el desarrollo posterior de la técnica que que llevó el estudio de las membranas excitables a otro nivel de complejidad.
     Posteriormente Fricke (1933) aplicó el tratamiento teórico de Maxwell al cálculo de la capacitancia específica de la membrana, obteniendo un valor de 0.81 uF/cm2; más aún, suponiendo un valor de 3 para la constante dieléctrica de la membrana, calculó su grosor en 3.3 nm, lo que equivale aproximadamente a la longitud de 1 molécula. Así, cuando Danielli (1935) examinó los potenciales de superficie de películas de lípidos y obtuvo 4 para la constante dieléctrica de la membrana, que no era muy diferente al obtenido por Höber, sobre la base de estos estudios y los de Gorter y Grendel (1925), se decidió que la membrana biológica estaba formada por una bicapa.
     Sin embargo, la bicapa de lípidos no quedó firmemente establecida como la base de la membrana hasta que el desarrollo de la microscopía electrónica finalmente proporcionó evidencias directas de su presencia y reveló que su grosor era cercano a 7.5 nm (Robertson, 1957). Aún así, su completa generalización todavía tuvo que esperar hasta los estudios con rayos-X (Robertson, 1959). Más recientemente se han identificado varios elementos proteicos dentro de la membrana que estan asociados con el control del flujo de iones o con mecanismos para su transporte activo.

2. La estructura de la membrana

     A principio del siglo XX ya se sospechaba la naturaleza lipídica de la membrana, principalmente sobre la base de los estudios iniciales sobre permeabilidad y las estructuras consideradas como posibles se basaban principalmente en dos hipótesis: 1) la membrana está formada por lípidos arreglados esencialmente en una capa homogénea, o en una emulsión capaz de cambiar de aceite en agua a un sistema de agua en aceite según las circunstancias (Clowes, 1916), y; 2) la membrana era de naturaleza principalmente proteica, ya que se podía hacer que aquellas derivadas de proteinas tuvieran una selectividad basada en el tamaño molecular (efecto de coladera), que parecía predominar en algunas células, como las bacterias Beggiotoa mirabilis  (Pfeffer, 1890). Más aún, las membranas en mosaico, con regiones de lípidos y de proteinas espacialmente separadas, permitirían explicar los efectos de solubilidad lipídica así como los de coladera, pero era necesario conocer el grosor de la membrana.
     Varios estudios en plantas mostraban una correlación bastante aceptable entre la plasmólisis y la velocidad de penetración, con los coeficientes de distribución aceite-agua. Se sabía que generalmente las moléculas pequeñas no penetraban más rápidamente que las grandes, que las moléculas polares eran más lentas que las moléculas neutras del mismo tamaño y que los iones eran aún más lentos.

3. El grosor de la membrana

     La membrana no se podía resolver con el microscopio de luz, lo que significaba que no podía ser mucho más gruesa de 120 nm, pero entre este valor y la longitud de una sola molécula de acido graso (~3 nm) había mucho espacio para especulaciones. Así, cuando Fricke (1923) no solamente confirmó que la capacidad de la membrana del eritrocito era de aproximadamente 1 uF/cm2, sino que suponiendo que estaba compuesta por aceite con una constante dieléctrica de 3 calculó que esa capacidad correspondería a un grosor de 3.3 nm, obtuvo la primera indicación de que la membrana era de dimensiones moleculares.
     Sin embargo, la contribución clásica a la solución del problema del grosor de la membrana fue la de Gorter y Grendel (1925). Ellos extrajeron los lípidos de eritrocitos por medio de acetona y después disolvieron el residuo evaporado en un poco de benzeno, esparciendo el lípido sobre la superficie de un surco de Langmuir. El área de la película cubierta por los lípidos fue reducida lentamente empujando con una barra de vidrio sobre la superficie del agua y forzando los lípidos contra la barrera opuesta, y tan pronto como la película empezó a ejercer una resistencia detectable a la compresión, midieron el área ocupada. Supusieron que en esa área las moléculas de lípidos estarían bien empacadas, lo que daría una película coherente en la que las terminales polares, insolubles en agua, se proyectarían hacia el aire. Esa medición proporcionó el área total que los lípidos eran capaces de cubrir.
     Después, Gorter y Grendel midieron las dimensiones de los eritrocitos aplicando la fórmula de Knoll y concluyeron que la membrana era una capa bimolecular. Posteriormente Grendel (1934) analizó el total de lípidos extraidos y partiendo de las superficies ocupadas por las moléculas de los diferentes constituyentes, concluyó que las contribuciones relativas, en términos de áreas de dispersión, eran, colesterol 36%, cefalina y lectina 50% y esfingomielina 13%. Además, calculó que la doble capa de lípidos tendría un grosor promedio de 3.1 nm (mediciones por medio de rayos-X han proporcionado valores de 6.3 nm; Finean, 1961).

4. El papel de la membrana

     El papel de la membrana celular en la génesis del fenómeno bioeléctrico fue postulado inicialmente por Ostwald (1890) cuando, basado en experimentos con membranas sedimentadas, concluyó que, "las membranas semipermeables son el lugar donde se inicia un cambio brusco de potencial... no solamente las corrientes en músculos y nervios, sino también los efectos extraños de los peces eléctricos pueden ser explicados por ... las propiedades de las membranas semipermeables."
     Posteriormente Hamburger (1902) aplicó los mismos principios sobre coeficientes osmóticos y plasmólisis obtenidos de células vegetales y demostró inequívocamente que el eritrocito, aunque 'efectivamente' impermeable al NaCl y KCl era, sin embargo, permeable a aniones como el cloruro y nitrato. Este concepto de las permeabilidades específicas a los iones ya había sido previsto por Ostwald (1890).
     Sin embargo, la especulación básica más conocida es la de Bernstein (1902), quien dijo que como las células vivas estaban rodeadas por una membrana con una permeabilidad baja para los iones, esto permitiría predecir que al aplicar una corriente eléctrica los iones pasarían principalmente alrededor de las células. Ya en 1899 Stewart había demostrado que la conductividad de la sangre disminuía cuando la concentración de eritrocitos en un recipiente aumentaba. Por lo tanto, la siguiente pregunta era, que parte de los eritrocitos contribuía a la resistencia alta; esto es, si el interior estaba lleno con un electrolito buen conductor de la electricidad, entonces solamente la hasta entonces hipotética membrana contribuiría con la resistencia.