4. Conductancias Iónicas

1. Historia

     En el verano de 1947 Hodgkin escribió a Cole contándole que junto con Katz (1949) habían encontrado que el responsable de la despolarización y el sobretiro del potencial de acción del axón gigante del calamar era el sodio. Para esto, tan pronto como pudieron después de la Segunda Guerra Mundial, Hodgkin había viajado con Katz a Plymouth, donde hicieron experimentos que mostraron que el potencial de acción era proporcional al logaritmo de la concentración externa de sodio, incluso para soluciones hiperosmóticas. Interpretaron sus datos experimentales de acuerdo con la ecuación de Goldman (1943), obteniendo un aumento transitorio de la permeabilidad en reposo para el sodio, relativa a la del potasio y cloruro, que pasaba de (PK:PNa:PCl = 1.0:0.04:0.45) a (PK:PNa:PCl=1.0:20:0.45), para después del máximo del potencial de acción regresar a (PK:PNa:PCl=1.8:0:0.45).
     Asi, antes de 1948, Hodgkin, Huxley y Katz tenían una idea clara del significado de la permeabilidad transitoria al sodio durante el impulso, así como ideas sobre sus fases de despolarización y repolarización; aparentemente lo único que les faltaba era como avanzar en ese problema sin el control de voltaje.
     En un simposium en Paris Hodgkin, Huxley y Katz (1949) dieron detalles de su equipo experimental y presentaron suficientes resultados para mostrar que estaban seguros de adonde querían llegar. Sin embargo, habían desarrollado un sistema de transportador para el sodio, que requería la aparición inmediata de una corriente de sodio, que después decaería más o menos exponencialmente y sería inactivada tal vez por el calcio.
     Eventualmente Hodgkin y Huxley abandonaron esa hipótesis y en el Congreso de Fisiología en Copenhagen, en el verano de 1950, mostraron a Cole sus datos sobre las conductancias al sodio y potasio analizadas como funciones del tiempo y potencial. Así, el Journal of Physiology indica que sus primeros cuatro trabajos fueron recibidos el 24 de octubre de 1951 y el quinto trabajo el 10 de marzo de 1952, lo que indica que tuvieron solamente dos estaciones de calamares en Plymouth y cuatro años de tiempo para hacer el trabajo.

2. El potencial de acción

     Cuando se aplica un pulso pequeño de corriente de salida a un axón, la disminución en la carga del capacitor difunde longitudinalmente. Después de un pulso mayor, el sistema control del Na+ se abre un poco para permitir alguna entrada de sodio y este potencial difunde solamente una distancia longitudinal corta antes de ser controlado por la respuesta lenta del sistema control del K+. Un pulso más grande que aumente el potencial por unos 20 mV, hace que el sistema control del Na+ permita más corriente de entrada, la que no solamente aumentará el potencial sino que difundirá interna y externamente a lo largo del axón para llevar las áreas más cercanas al potencial al que aparecerá una corriente neta de entrada. Entonces, al igual que en el sitio de estimulación, el sistema control del Na+ responderá para dar una gNa más rápida y grande, y se inicia el curso completo de la excitación. Conforme el potencial se dirige hacia la respuesta completa, también manda una cantidad mayor de corriente de entrada más y más lejos en el axón, para llevar la actividad primero a los puntos cercanos y después a los lejanos. Asintóticamente el proceso se convierte en un impulso con velocidad constante, autosostenido.
     Cuando un impulso se aproxima a una velocidad de cerca de 20 m/seg, el potencial de la membrana se desplaza hacia cero y empieza a abrirse una compuerta que permite el paso del Na+. Conforme unos iones entran bajo la fuerza tanto del campo eléctrico como del gradiente de concentración, empiezan a neutralizar el exceso en la concentración interna de iones negativos y ayudan a llevar el potencial hacia cero. A su vez, este cambio de potencial aumenta rápidamente la entrada de iones Na+, lo que resulta en un proceso autorregenerativo que lleva el potencial más allá del potencial cero. Después, conforme aparece un exceso interno de cargas positivas, la fuerza que lleva los Na+ hacia dentro se pierde y el potencial se invierte, con lo que la fuerza hacía dentro es reemplazada por una oposición que retrasa la entrada de Na+, ya que ahora se acerca a un nuevo equilibrio alrededor de +50 mV, el ENa. Durante las últimas etapas de este proceso, la vía para el sodio lentamente empieza a presentar más dificultades, además que para entonces se permite el paso del K+ más libremente, lo que resulta en un máximo para el potencial.
     Conforme el flujo de Na+ se detiene, ocurre una recuperación más lenta debido a la salida de iones K+, que alcanza un máximo alrededor del potencial cero. Esta velocidad de declinación ocurre en parte debido a que de nuevo hay un exceso de iones negativos en el interior y a la reducción en la facilidad del movimiento de K+ al valor mínimo con el que empezó. Así, el impulso es solamente una ganancia rápida de Na+ seguida de una pérdida más lenta de K+, lo que obviamente no puede continuar indefinidamente sin otro proceso metabólico, diferente y mucho más lento, que bombea el Na+ extra y lo reemplaza con K+.

3. El Control de Voltaje

     La serie de trabajos por Hodgkin, Huxley y Katz (1952) y por Hodgkin y Huxley (1952a-d) es de importancia trascendental para el desarrollo de nuestra ideas sobre la excitabilidad de la membrana. Esos trabajos proporcionan información obtenida con la técnica del control de voltaje, que no había estado accesible por ningún otro método experimental y además, como están basados en ideas desarrolladas por muchos investigadores en años previos, reúnen todo lo que sabía hasta entonces sobre el proceso de la excitación que da origen al potencial de acción. Estas ideas fueron tan completamente sintetizadas, que ahora solamente es necesario describir su punto de vista y todos los principios básicos estarán incluidos.
     La hipótesis que Hodgkin y Huxley se propusieron probar era la siguiente: la membrana tiene canales que permiten el paso de iones en la dirección que determine su potencial electroquímico. Este movimiento iónico produce corrientes eléctricas y produce el cambio conocido como 'potencial de acción,' que se debe a un aumento en la conductancia al ion sodio (gNa) que le permite entrar a la célula haciendo positivo el interior, lo que a su vez aumenta la gNa aún más. Esa conductancia también cambia como función del tiempo y empieza a disminuir aproximadamente hacia el máximo del potencial de acción, por lo que gNa = f(t,V). Simultáneamente, la conductancia a los iones potasio también está cambiando como función del potencial y del tiempo y, por lo tanto, gK = f(t,V). Así, el problema a resolver era: ¿cuál es la función del tiempo y del voltaje que describe las conductancias gNa y gK?
     En ese proceso hay tres variables dependientes del tiempo (gNa, gK y V) que interactúan entre sí y, para hacer el problenma más complicado, todo el proceso de cambios en el potencial se desarrolla a una gran velocidad, con un cambio máximo de aproximadamente 700 V/seg.
Esta serie de eventos fue probada por medio de experimentos hechos con la técnica del control de voltaje, usando el siguiente paradigma experimental:
  1. Cambiar el potencial transmembrana en pasos, lo que requiere trabajar con un área de membrana que llene dos requisitos: a) isopotencialidad en la región de la que se registre la corriente (control de espacio), y; b) control instantáneo del potencial por medio de un circuito electrónico de retroalimentación (control de voltaje).
  2. El cambio brusco en el potencial de membrana produce un aumento en la conductancia, lo que induce el movimiento de iones y, como consecuencia, la generación de corriente eléctrica. Entonces, para mantener constante el potencial transmembrana el circuito electrónico proporciona, o retira, una corriente que es igual pero de signo contrario a la que se produce por el movimiento iónico.
  3. La corriente de membrana tiene que ser separada en sus tres componentes
    Im = IK + INa + IL

  4. A partir de sus componentes individuales y aplicando la ley de Ohm, calcular las conductancias individuales. Esto es posible porque los otros parámetros de las ecuaciones son conocidos, ya que el voltaje transmembrana (Vm) es determinado por el circuito electrónico y los potenciales de equilibrio de los iones sodio y potasio (ENa y EK) pueden ser medidos.

    IK = gK (Vm - EK)      INa = gNa (Vm - ENa)

    Este es el paso crucial del método, ya que consiste en la medición eléctrica del movimiento iónico y, a partir de éste, el cálculo de las conductancias iónicas.
  5. Reintroducir el potencial transmembrana como una variable, repitiendo los pasos 1-4 para varios niveles de potencial. A partir de esos resultados derivar expresiones matemáticas que relacionen la conductancia con el tiempo y el voltaje transmembrana.
  6. Una prueba de que el procedimiento era adecuado sería calcular un potencial de acción a partir de las expresiones matemáticas empíricas. Si el potencial calculado era parecido y además tenía propiedades como las del verdadero, esto se consideraría como una prueba adecuada de que la hipótesis inicial era correcta.

     Los datos experimentales fueron analizados en términos de conductancias iónicas y este concepto es tan atractivo y útil que puede llegar a ser decepcionante, sobre todo si olvidamos que las conductancias fueron expresiones utilizadas para caracterizar el proceso completamente desconocido por el que los iones cruzan las membranas. Así, esa descripción pasará a la historia como la primera descripción clara, general y suscinta de los problemas de la permeabilidad iónica.
     Desde el punto de vista matemático, es impresionante que las conductancias iónicas sean descritas completamente en términos de una condición inicial, una constante de tiempo y un estado estacionario, y que cada una de ellas sea solamente función del potencial de membrana. Además, esa descripción ha sido extraordinariamente exitosa, lo que parece decir que es cierto que las características iónicas de la membrana están determinadas en forma unívoca por la diferencia de potencial a través de ella. Asó, si las propiedades iónicas están determinadas totalmente por el potencial de membrana, deben ser observadas en forma simple y directa por medio de experimentos en los que el potencial de la membrana sea la variable independiente, lo que quizá sea la razón por la que el control de voltaje resultó más poderoso que lo que se esperaba sobre la base del concepto de estabilidad simple con el que fue desarrollado.

4. Las ecuaciones

     Para describir el inicio y la terminación de la conductancia al sodio, así como el inicio de la del potasio, Hodgkin y Huxley (1952) expresaron los resultados obtenidos durante los experimentos con el control de voltaje en términos de tres parámetros sin dimensiones, n, m, h, que varían entre 0 y 1,. Supusieron que cada uno de estos parámetros obedece una cinética de primer orden,
dn/dt = an (n-n) - bn n
donde an es la tasa de cambio hacia delante y bn la tasa de cambio hacia atrás; en condiciones normales serían solamente funciones del potencial de membrana, V. Para ajustar las ecuaciones a los datos experimentales expresaron la conductancia como,
gK = gK n4   y   gNa = gNa m3h
y escogieron las expresiones analíticas de las a's y b's para proporcionar el mejor ajuste al patrón del análisis de Goldman (1945). En su forma original, para despolarizaciones desde el potencial de reposo, fueron,

an = 0.01(V+10)/(exp((V+10)/10)-1)      bn = 0.125 exp (V/80)
am = 0.01(V+25)/(exp((V+25)/10)-1)     bm = 4 exp (V/18)
ah = 0.7 exp (V/20)     bh = 1/(exp((V+30)/10)+1)

Después estaban las constantes,
gK = 36 mmho/cm2     EK = 12 mV
gNa = 120 mmho/cm2     ENa = -115 mV
y la corriente de fuga, lineal
gL = 0.3 mmho/cm2     EL = -10.6 mV

     Las ecuaciones de H-H son expresiones empíricas de los datos obtenidos durante experimentos con el control de voltaje y producen una representación razonable de ellos. Con esas descripciones de las corrientes iónicas de la membrana como función del potencial de la membrana fue entonces posible regresar y observar la fisiología de un axón en condiciones normales, ya que los factores adicionales son relativamente simples.
     La adición de la capacitancia de la membrana completa la descripción de la corriente a través de la membrana
Im = C dV/dt + Ii

     Estas corrientes y potenciales fueron llamados "de membrana," aunque el término menos ambiguo de "control de espacio" también ha sido usado. Sin embargo, en el axón sin electrodos llegamos a una combinación de la ecuación del cable con las corrientes iónicas, que resulta en un potencial de acción propagado,
(1/(re+ri)) (d2V/dx2) = C (dV/dt) + Ii

     En principio hay soluciones analíticas a esta ecuación diferencial parcial de tipo parabólico, como aquella en la que se hace la suposición de una velocidad constante de propagación. Así, para
V = f (t - x/Ø)
donde Ø es la velocidad del impulso, la solución da

(1/(Ø^2 (re + ri)) (d2V/dt2) = C (dV/dt) + Ii

que es de nuevo una ecuación diferencial ordinaria para el cable, pero ahora conteniendo el parámetro desconocido Ø.
     Además de su uso como expresiones de las corrientes iónicas obtenidas durante experimentos con el control de voltaje, Hodgkin y Huxley interpretaron estos datos como corrientes iónicas de sodio y potasio, con lo que las ecuaciones son una representación formal y completa de la "Teoría del Sodio," reemplanzado las descripciones anteriores, comparativamente cualitativas. Cole (1968) menciona que un título descriptivo más completo del trabajo podría haber sido: "A Theory that a Sodium Ion Permeability, Controlled by the Membrane Potential, is Responsible for the Impulse Excitation and Propagation of the Squid Axon in Its Normal Environment and Under Normal Conditions, with the Hope and Expectation that the Theory Will Apply to Some Other Excitable Cells and Under Some Other Conditions."
     La selección de cinética enzimática para las ecuaciones puede haber sido por conveniencia, pero también está basada en la creencia de que podría corresponder a algún mecanismo intrínseco de la membrana; además, H&H presentaron los parámetros n, m y h como probabilidades de que sitios en la membrana puedan ser activados para permitir la recepción y el paso de los iones. La activación simultánea de cuatro de esos sitios sería necesaria para el paso de iones potasio e, igualmente, se requerirían tres sitios para el paso de iones sodio, pero en este caso también sería necesario desbloquear otro sitio, denominado h, que corresponde a la inactivación.
     Ya que el axón de HH separa los componentes del sodio y potasio de las corrientes iónicas, está postulando mecanismos membranales independientes y por tanto podría considerarse un modelo. Sin embargo, las ecuaciones y el circuito equivalente son expresiones puramente empíricas de los datos experimentales, como las descripciones de dos cajas negras vistas desde el exterior. Así, al no basarse en hipótesis o modelos de los mecanismos internos de la membrana, no pueden considerarse modelos.
     Hodgkin y Huxley (1952d) presentaron como su primer resultado el potencial de acción obtenido en respuesta a un breve estímulo supraumbral, que compararon muy favorablemente con un registro real. Otro parámetro del potencial de acción real también obtenido por Hodgkin y Huxley fue la velocidad de propagación. Para esto superaron el problema de obtener soluciones analíticas para la ecuación no-lineal del cable originada por Kelvin y explicaron que era relativamente más fácil resolver la ecuación si el impulso se propagara a una velocidad uniforme; con esta suposición reescribieron la ecuación, que se convirtió en una ecuación diferencial de 2o orden.

Ii + C dV/dt = (1/K) (d2V/dt2)

     Por supuesto, esta ecuación es mas simple que la ecuación parcial diferencial, de la que es solamente un caso especial, pero la única base para la velocidad constante de propagación era experimental. Sin embargo, por medio de ensayos en los que aproximaron paulatinamente la velocidad al valor constante, Hodgkin y Huxley resolvieron la ecuación hasta un poco más allá del valor máximo del potencial de acción; el resto fue calculado del potencial obtenido durante el control de corriente y el resultado añadido al potencial calculado inicialmente.
     Posteriormente y aunque no estaban tratando de probar la solución obtenida por Hodgkin y Huxley, Cole y cols (1955) repitieron la solución, esta vez en la computadora SEAC. Sin embargo, la medición de la velocidad de propagación del potencial de acción obtenido por las ecuaciones tuvo que esperar hasta que fue posible resolver la ecuación diferencial por medio de su transformación a una ecuación de diferencias (Cooley y Dodge, 1966).