Estudio de la Toxina Colérica y Otras Citotoxinas de Cepas de Vibrio Cholerae 01 en Células Vero
M. en C. María Guadalupe Rodríguez A.*


Introducción: Vibrio cholerae es el agente etiológico de la infección intestinal aguda denominada cólera. La toxina es el principal mecanismo de patogenicidad, aunque no el único ya que se han reportado otras toxinas como: factor ZOT (zonula occludens toxin) asociado a cepas diarrogénicas y un factor ACE (accesory cholera enterotoxin). En cepas de V. cholerae No. 01 se han encontrado toxinas semejantes a Shiga (SLT) que causa un efecto citotóxico.

La detección de toxina colérica se realiza en asa ligada de conejo, en células Y1, CHO y VERO y métodos inmunológicos como ELISA. Actualmente una aplicación del uso de sondas en la investigación básica es que permite la subcaracterización de las cepas de V. cholerae 01 en toxigénicas y no toxigénicas.

Objetivo: Demostrar y describir una citotoxina diferente a las hasta ahora descritas para cepas de V. Cholerae 01 silvestres, que pueda estar relacionada con el factor ZOT o ACE reportado para cepas vacunales.

Material y métodos: Se determinó la toxigenicidad en cepas de V. cholerae 01, aisladas de casos de diarrea en cultivo de células Vero. La toxina se obtuvo sembrando la cepa en medio de Craig y se incubaron a 37oC durante 24 horas. Se centrifugó y 20 µ1 de la toxina se adicionaron a células Vero. El efecto se observó a 1, 3, 25, 48 y 72 horas. En las cepas citotóxicas, se realizaron diluciones de 10-1 a 10-6.

Se realizó asa ligada de conejo y rata. En cada asa de conejo se inoculó 0.5 ml de sobrenadante de cultivo bacteriano y en las de rata 0.1 ml. Se dejó en observación de 6-24 hrs. Se observó el acumulo de líquido, así como la longitud del asa.

La hemólisis se realizó sembrando las cepas en placas de agar sangre al 5 por ciento con glóbulos rojos de humano y de borrego, incubadas a 37oC.

La hemólisis en tubo se realizó inoculando las cepas en caldo BHI. Se incubó a 37oC por 24 hrs. Se centrifugó para obtener el sobrenadante. El sobrenadante se diluyó 1:2 con una suspensión al 5 por ciento de glóbulos rojos de carnero.

La PCR se realizó según el método del CDC de Atlanta, empleando los iniciadores CTX2 y CTX3 con 30 ciclos para la amplificación.

El ``colony blot'' se realizó sembrando las cepas en placa y sobre ellas se colocó una membrana de nylon. Se incubó la placa hasta las 24 hrs. Después se retiró la membrana y se rompieron las células con hidróxido de sodio para liberar el DNA de la bacteria, el cual después se fijó a 80oC durante 1 hr. La hibridación se realizó a 65oC con la sonda específica para CT, LT y ST. Se reveló colorimétricamente con NBT y BCIP.

Resultados: Las cepas presentaron efecto citotónico característico de CT y en un 5-10 por ciento se observó efecto citotóxico (arredondamiento y lisis de las células). El efecto citotóxico no fue característico de un serotipo en particular ni es exclusivo de cepas multirresistentes.

Al realizar diluciones de 10-3 a 10-4 de los sobrenadantes de cepas citotóxicas, se observó que algunas cepas presentaron un efecto citotónico y otras cepas presentaron efecto citotóxico con granulaciones y vacuolas.

En asa ligada de conejo y rata una cepa citotóxica causó acumulación de líquido con un aspecto hemorrágico, en el cual se encontró alta concentración de hemoglobina. La prueba de hemólisis en placa y en tubo se estandarizó con cepas de referencia y una cepa citotóxica que fue negativa para ambos métodos.

La PCR amplificó un fragmento de 564 bp en las cepas citotóxicas y en cepas que por dilución fueron citotónicas.

Las hibridaciones por ``colony blot'' son sondas específicas para CT, LT y ST, mostraron que todas las cepas estudiadas tanto citotóxicas como citotónicas fueron capaces de hibridar con CT y ninguna hibridó con LT y ST.

Discusión: La citotoxina es diferente a la toxina colérica. Los eritrocitos de carnero y humano tal vez no sean sensibles a la citotoxina, y se deba probar con eritrocitos de otras especies animales.

El ensayo de asa ligada de conejo y rata, indican la presencia de una hemolisina que pudiera ser semejante a la producida por cepas de V. cholerae No. 01 y otras especies de Vibrio. Había posibilidad de que las cepas citotóxicas no produjeran la toxina colérica y por eso esperábamos que al realizar PCR dirigida a amplificar un fragmento de la subunidad A de la toxina colérica, fuera negativa en cepas citotóxicas pero se observó que ambas cepas tenían la información para la síntesis de la subunidad A de la toxina.

La hibridación por "colony blot" fue negativa con la sonda de ST de E. coli debido a que la sonda empleada es de 168 pb específica para E. coli y no para la toxina ST descrita para V. cholerae, aunque no se debe descartar la posibilidad de que sea una toxina no termosensible.

Conclusiones: En cepas citotóxicas de V. cholerae 01 se encontró que:

*Laboratorio de Bacteriología Molecular. INDRE, SSA.